通过贴片移植胆管树干细胞类器官体植入肝脏的移植技术
撰文│杨 勇 何志颖 张文成
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
胆管树干细胞（BTSCs）存在于人体胆道系统，可分化为肝细胞、胰岛细胞和胆管上皮细胞，是实现干细胞再生肝脏的理想种子细胞。研究人员通过透明质酸（HA）水凝胶包埋BTSCs类器官体后，再与脱敏蚕丝生物材料组合形成BTSCs贴片。通过手术方式将BTSCs贴片移植至肝脏表面，或置于肝叶之间，1周内可实现BTSCs向肝脏的高效迁移和定植，3周后定植的BTSCs可分化为成熟的肝细胞。
制定合理的干细胞移植途径是治疗肝病的关键环节。研究表明，目前临床常用的肝细胞或干细胞移植途径主要包括血管输注、脾脏移植等。这些通过血液途径输注的方式具有手术创伤小、操作简单等优势。但这些方法存在血管栓塞风险，且定植效率低，仅有不足15%的移植细胞可定植受体肝脏，剩余细胞的异位定植存在长期安全隐患。另一移植策略为肝内直接注射，这种移植方法是将移植细胞或干细胞包埋于HA等细胞外基质水凝胶中，通过直接注射将细胞移植入肝包膜下，从而实现肝细胞或干细胞向肝脏的直接移植。该方法移植效率高、易于操作。然而，肝脏属实质脏器，肝包膜下单剂注射体积有限，从而导致移植细胞数量受限。此外，直接注射移植可能会导致肝包膜破裂，这种情况尤其在纤维化病变的肝脏中易于发生，并不适合纤维化肝病患者，在临床应用中受限。因此，肝病治疗的干细胞移植临床应用亟需一种更加安全且易于操作的移植技术。
同济大学附属东方医院再生医学研究所张文成所在课题组为解决肝病有关移植途径的关键环节，创新性地建立了一种新的贴片移植策略。为更好地模拟临床应用，研究人员选用常用大型动物——猪，作为研究模型。首先验证了在猪的胆道中存在和人BTSCs相似特定的猪胆管树干细胞（pBTSCs）。通过构建组蛋白H2B偶联表达GFP的转基因猪作为供体，以野生型小猪作为受体，建立贴片移植手术策略。将HA水凝胶包埋好的pBTSCs置于脱敏蚕丝医用敷料上，并贴至3～4周猪的肝左中叶，利用手术缝合进行固定后，再用3M组织胶水黏合，完成贴片移植。移植3周后结果表明，贴片移植可实现贴片移植物内的干细胞全部植入肝脏，即实现100%定植效率。脱敏蚕丝医用敷料短期在体内无异物反应和炎症反应。通过对贴片外表面进行HA水凝胶包被处理，可有效防止贴片移植引起的腹腔粘连等副作用。筛选的新材料能够支撑贴片移植物并保证移植物的结构，且不改变细胞形态，实现了pBTSCs的原位移植。同时，贴片移植物不会对移植器官原位环境进行影响，保证了pBTSCs依据体内微环境进行可控性的定向诱导分化。因此，该研究建立的贴片移植是一种精确可控、安全高效的移植策略。
前期研究表明细胞外基质的软硬度对人的胆管树干细胞（hBTSCs）体外维持和命运调控具有直接作用。软的细胞外基质是维持hBTSCs必要条件，hBTSCs混合软的HA，可促进hBTSCs在小鼠肝脏内定植。因此，研究人员通过可精确调节软硬度的HA并对不同软硬度的HA凝胶进行牵拉力和机械力测定后，构建了3层HA，层外加一层脱敏蚕丝背衬组成的pBTSCs的贴片移植物。包埋pBTSCs的贴片移植物的具体构造从肝组织表面开始：第1层为用于包埋pBTSCs软硬度为69帕的1X HA水凝胶；第2 层为用于支撑贴片移植物并保证移植物结构的脱敏蚕丝手术敷料；第3层为用于阻止pBTSCs向腹膜方向迁移的软硬度为760帕的10X HA 水凝胶；第4层为用于防止贴片移植物造成的异物组织粘连软硬度为107帕的2X HA水凝胶。3种不同硬度的HA凝胶，可通过HA和其交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）的浓度和比例来实现。第1层为1X HA 水凝胶通过0.5%（w/v）的PEGDA和1.0%（w/v）的Glycosil按体积4∶1交联；第3层为10X HA水凝胶通过0.5%（w/v）的PEGDA和2.0%（w/v）的Glycosil 按体积2∶1交联；第4层为2X HA水凝胶通过0.5%（w/v）的PEGDA和1.0%（w/v）的Glycosil按体积2∶1交联。本研究通过明确贴片移植物中的贴片成分和构造层次，为贴片移植的临床转化应用铺平了道路。
干细胞治疗肝病的另一关键问题是细胞移植后迁移和定植机制。基于造血干细胞的归巢和定植研究，研究人员发现金属基质蛋白酶（MMP）在多种生理、病理过程及组织重构中起着至关重要作用。通过对移植部位的组织进行观察发现，移植部位组织发生了组织重塑现象。在组织重塑部位中检测到大量的MMP-1和MMP-2表达，同时检测到大量正在迁移的pBTSCs。对pBTSCs的基因表达谱进行鉴定，证实pBTSCs的MMP-1和MMP-2的表达水平远高于成熟肝细胞。为进一步验证这一机制，对不表达MMP的成熟肝细胞通过贴片技术进行移植，检测结果发现肝细胞并未向肝组织内迁移，由此研究人员认为，pBTSCs通过贴片移植技术发挥原位移植的重要作用机制是干细胞分泌的MMP增多，特别是MMP-1和MMP-2增多，对移植部位的组织进行重塑从而使pBTSCs 迁移至肝脏组织内。研究中对BTSCs 移植后迁移和定植的探讨是干细胞在疾病治疗中发挥疗效及安全性的关键所在。
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